本发明涉及一种抗氧化肽及其制备方法。本发明利用花生粕及自制的成曲酶，通过酶法水解，得到花生粕酶解液，再利用超滤膜、凝胶过滤色谱及反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到一种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。该产品的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，分子量为325.3Da，具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力是还原型谷胱甘肽的4倍，而且该肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
1.一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：（1）成曲酶的制备：将10～30g麸皮，5～20g花生粕，0.01～0.1g氯化钙和15～50g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100～121℃下杀菌15～30min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱28～32℃培养48～72h；加入200mL去离子水，在30-50℃水浴中搅拌1-3h，在0-4℃下5000～10,000xa0×xa0g离心20～30min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶；（2）花生粕酶解物的制备：将花生粕与水按质量比1：4～1：8混合，加入占花生粕蛋白质量0.4%～1%的成曲酶，在50～55℃酶解4～24h；85～95℃下灭酶15～30min，离心，取上清液，得到花生粕酶解液；（3）抗氧化肽的分离纯化：将花生粕酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；再用Sephadexxa0G-15凝胶柱进行分离纯化，用去离子水以0.6～2xa0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，然后冷冻干燥得粉末A；（4）将粉末A溶于水后用反相高效液相色谱进一步纯化，色谱柱为XBridgexa0prexa0C18xa0柱，流动相为A相和B相，洗脱程序为：0-4min内采用的流动相中A与B体积比为5:95-10:90,xa04-8min内采用的流动相中A与B体积比为10:90-30:70，8-12min内采用的流动相中A与B体积比为30:70-50:50，12-30min内采用的流动相中A与B体积比为50:50，流速为2ml/min，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述A相为甲醇，B相为质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液。
3.由权利要求1所述制备方法制得的抗氧化肽，其特征在于，具有Tyr-Gly-Ser的氨基酸序列。技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种抗氧化肽的制备方法。
背景技术
自从英国Harman于1956年提出自由基理论以来，人们逐步认识到人体许多慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、神经组织退化紊乱、癌症及衰老都与体内氧化产生的自由基有关，因而抗氧化剂的研究越来越被人们所关注。传统使用的抗氧化剂大多为合成抗氧化剂，如二叔丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基羟基茴香醚(BHA)，由于廉价而且具有很强的抗氧化能力而被广泛使用，但是由于其对人体健康构成潜在的危害而被限制使用。因此，寻找和开发安全、无毒的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。天然抗氧化肽是存在于动植物体中具有抗氧化活性的肽类，它具有清除自由基、螯合金属离子、猝灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，易被人体吸收，无毒副作用，营养和加工特性良好，因此在人类食品和药品中具有巨大的开发前景。目前也有很多学者采用酶解的技术从植物或者动物组织中制备得到活性很强的抗氧化肽。发明申请专利（申请号201010141974.3）公开了一系列的胶原蛋白抗氧化肽，具有如下之一的氨基酸序列：(1)Hyl-Cys；(2)Gln-Gly-Ala-Arg；(3)Leu-Gln-Gly-Met；(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp，该产品抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分，而且具有分子量小的特点，易被消化道直接吸收。发明申请专利（申请号200510009423.0）公开了通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等强度的强抗氧化能力的三种抗氧化肽，氨基酸序列为：(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。花生粕是花生仁经过榨油后的副产物，含有丰富的蛋白质，但由于在榨油过程中经历了高温压榨和溶剂浸提的过程，导致花生蛋白严重变性，色泽和气味恶化，目前主要用作饲料或肥料。但是我国每年有几百万吨的花生粕，来源广泛、价格低廉，因此如何充分开发利用花生粕中的蛋白质资源，提高其附加值，是植物蛋白资源综合利用的重要环节。xa0
发明内容
本发明的目的在于提供一种原料来源丰富廉价，且抗氧化活性很强的抗氧化肽及其制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，具体技术方案如下。一种抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：（1）成曲酶的制备：将10～30g麸皮，5～20g花生粕，0.01～0.1g氯化钙和15～50g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100～121℃下杀菌15～30min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱28～32℃培养48～72h；加入200mL去离子水，在30～50℃水浴中搅拌1～3h，在0～4℃下5000～10,000xa0×xa0g离心20～30min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶。（2）花生粕酶解物的制备：将花生粕与水按质量比1：4～1：8混合，加入以花生粕蛋白质量计0.4～1%的成曲酶，在50～55℃酶解4～24h；85～95℃下灭酶15～30min，离心，取上清液，得到花生粕酶解液；（3）抗氧化肽的分离纯化：将花生粕酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；再用凝胶过滤色谱柱G-15进行分离纯化，用去离子水以0.6～2xa0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，然后冷冻干燥成粉末；（4）最后用反相高效液相色谱法进一步纯化，色谱柱为XBridge^TMxa0prexa0C18xa0柱(5μm,xa010×150mm;xa0Waters,xa0USA)，流动相为A相和B相，洗脱程序为：0-4min内采用的流动相中A与B体积比为5:95-10:90,xa04-8min内采用的流动相中A与B体积比为10:90-30:70，8-12min内采用的流动相中A与B体积比为30:70-50:50，12-30min内采用的流动相中A与B体积比为50:50，流速为2ml/min，检测波长为214nm。测定各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，冷冻干燥，得到目标肽。所述A相为甲醇，B相为质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液。用电喷雾串联质谱法测定肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，分子量为325.3Da。在本发明中，采用ORACxa0(Oxygenxa0radicalxa0absorbancexa0capacity，氧自由基吸收能力)法来测定抗氧化肽的活性。该方法现已经成为美国农业部、美国卫生院、FDA评价食品抗氧化能力的重要标准。欧洲、日本等国家的食品、功能食品行业也普遍采用ORAC作为抗氧化能力的重要评价标准，是目前评价体外抗氧化能力最权威性的方法。基于ORAC反应在75xa0mmol·Lxa0^-xa01磷酸盐缓冲液(pHxa0=7.4)环境中进行，FL（荧光素钠盐）、AAPH（自由基产生剂）、标准抗氧化物质Trolox（维生素E水溶性类似物）以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为：在96孔板各微孔中分别加入待测样品20μl，FL（终浓度为70xa0nmol·Lxa0^-xa01xa0）120μl，在37℃下预置15xa0min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH（终浓度为12xa0mmol·Lxa0^-xa01xa0）60μl启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485xa0nm，发射波长528xa0nm进行连续测定，每1xa0min测定一次各孔荧光强度，测定120min，荧光强度分别记为f₀，f₁，f₂···f₁₂₀。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据f_n与初始荧光强度f₀相比，折算成相对荧光强度，并根据公式AUC=1+xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="66"/>，统计荧光熄灭曲线下面积(AUC_sample)值，然后根据公式netxa0AUC=AUC_sample-AUC_blank，分别计算不同浓度Trolox和样品的netxa0AUC值，其中AUC_blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。采用上述方法，测定了本发明抗氧化肽YGS的抗氧化活性，并采用还原型谷胱甘肽（GSH）作为对照，结果见表1。表1xa0抗氧化肽YGS及谷胱甘肽的ORAC值 xa0 ORAC（μmol TE/μmol ） GSH xa00.45±0.01 YGS xa01.82±0.12 由表1可知本发明的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力是是GSH的4倍。本发明提供的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，可以作为抗氧化剂应用于食品添加剂、保健品、化妆品及护肤品等。本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：（1）本发明所用原料为花生粕，来源广泛，价格低廉；花生粕是花生榨油过程中的副产物，主要用作饲料或肥料。现在将其作为原料，开发成抗氧化肽，升值幅度是相当可观的。（2）本发明采用生物发酵法，自制成曲酶，然后利用酶解技术及色谱分离技术制备出一种新的抗氧化肽；（3）本发明提供的抗氧化肽活性很强，氧自由基吸收能力是谷胱甘肽的4倍，不仅可以用作食品添加剂，也可以作为功能性成分，用于保健品、化妆品及护肤品中；（4）本发明提供的抗氧化肽是一种三肽，分子量小，可被人体直接吸收；（5）本发明通过化学合成对应的抗氧化肽，经实验验证效果与分离纯化得到的新肽效果接近。xa0
附图说明
图1为Sephadexxa0G-15凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图1a为抗氧化活性测定图，图1b为色谱分离洗脱曲线。图2为半制备型反相高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图2a为抗氧化活性测定图，图2b为色谱分离洗脱曲线。图3为抗氧化肽的氨基酸序列的质谱分析图，其中，图3a为抗氧化肽的一级质谱图，图3b为母离子m/zxa0326.5的二级质谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的实施，但本发明的实施和保护不限于此。实施例1（1）成曲酶的制备：将20g麸皮，10g花生粕，0.05g氯化钙和30g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100℃下杀菌30min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱30℃培养48h；加入200mL去离子水，在30℃水浴中搅拌1h，在0℃下8000xa0×xa0g离心20min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶；（2）花生粕酶解物的制备：将花生粕与水按质量比1：7混合，加入以花生粕蛋白质量计的0.5%的成曲酶，在55℃酶解8h；95℃下灭酶15min，离心，取上清液，得到花生粕酶解液，水解度为34.6%；（3）抗氧化肽的分离纯化：将花生粕酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；然后进行Sephadexxa0G-15（?1.6×100xa0cm）凝胶过滤色谱分离纯化，用去离子水以1xa0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，共收集到4个组分，测定各组分的抗氧化活性，组分F4活性最高，收集组分F4，然后冷冻干燥成粉末；最后用反相高效液相色谱法进一步纯化，色谱柱为XBridge^TMxa0prexa0C18xa0柱(5μm,10×150mm;xa0Waters,xa0USA)，流动相为A相（甲醇）-B相（0.1%三氟乙酸），洗脱程序为：0-4minxa0内(A：B为5:95，体积比，下同),xa04-8min内(A：B为10:90),xa08-12xa0min内（A：B为30:70），12-30min（A：B为50:50），流速为2ml/min，检测波长为214nm。共收集到5个组分，测定各组分的抗氧化活性，组分P3活性最高，收集组分P3，然后冷冻干燥，得到目标肽；（4）将步骤（3）得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，从一级质谱产生的分子离子中选择m/zxa0326.5作为母离子，进入二级质谱，经过序列分析，得到该肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser。实施例2（1）成曲酶的制备：将24g麸皮，15g花生粕，0.06g氯化钙和35g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100℃下杀菌30min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱28℃培养72h；加入200mL去离子水，在50℃水浴中搅拌3h，在2℃下8000xa0×xa0g离心20min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶；（2）花生粕酶解物的制备：将花生粕与水按质量比1：7混合，加入以花生粕蛋白质量计的1%的成曲酶，在55℃酶解12h；95℃下灭酶30min，离心，取上清液，得到花生粕酶解液，水解度为36.3%；（3）抗氧化肽的分离纯化：将花生粕酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；然后进行Sephadexxa0G-15凝胶过滤色谱分离纯化，用去离子水以2xa0ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，共收集到4个组分，测定各组分的抗氧化活性，组分F4活性最高，收集组分F4，然后冷冻干燥成粉末；最后用反相高效液相色谱法进一步纯化，色谱柱为XBridge^TMxa0prexa0C18xa0柱(5μm,10×150mm;xa0Waters,xa0USA)，流动相为A相（甲醇）-B相（0.1%三氟乙酸），洗脱程序为：0-4min内xa0(A：B为10:90),xa04-8min内(A：B为30:70),xa08-12min内（A：B为40:60），12-30min内（A：B为50:50），流速为2ml/min，检测波长为214nm。共收集到5个组分，测定各组分的抗氧化活性，组分P3活性最高，收集组分P3，然后冷冻干燥，得到目标肽；（4）将步骤（3）得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，从一级质谱产生的分子离子中选择m/zxa0326.5作为母离子，进入二级质谱，经过序列分析，得到该肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser。实施3按照与实施2同样的实施方式进行，不同之处只是在55℃下酶解24h，得到花生粕酶解物，水解度提高至39.9%。图1为Sephadexxa0G-15凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图1a为抗氧化活性测定图，图1b为色谱分离洗脱曲线。由图1可见，组分F4活性最高。图2为半制备型高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图2a为抗氧化活性测定图，图2b为色谱分离洗脱曲线，由图2可见，组分P3活性最高。图3为抗氧化肽的氨基酸序列Tyr-Gly-Ser的质谱分析图。